western blot出现很多杂带，求助，交流

1. western blot出现很多杂带，求助，交流

1.因为WB的一抗识别的蛋白质的表位是顺序表位，不是空间表位，所以WB状态下的抗原-抗体识别，与非变性的生理条件下的抗原-抗体识别不同。
2.WB之前，先用分子筛纯化同时也是检测一下目的蛋白产物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表达了，而且在提取后稳定存在了。
3.非特异性的条带分子量偏大可能是SDS PAGE出的问题，胶的浓度不合适或者样品溶解度不够或者电泳时间不合适等，造成了目的条带的表观质量变大。
4.三个非特异性的分子量偏大条带之一可能是目的蛋白在SDS PAGE出的问题出了问题，另外两个带可能本来就是杂带了。可以回收后对三条带用质谱检测精确的分子量加以确定。
5.三个非特异性的分子量偏大条带至少应该有杂带，杂带出现而且与一抗相互作用，那么只能说杂带的顺序表位也能被一抗识别，必须更换专一性更高的抗体。
6.还有考虑你的镍柱亲和分离的问题，是不是获得了你的需要的目的蛋白质。

2. PCR目的条带的问题，急！

恐怕还是cDNA的问题，actin因为量比较丰富，所以即使破坏一些仍能P出来，但你的目的基因就不同了

3. pcr需要注意的问题

1、PCR产物的电泳检测时间：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。
2、假阴性，不出现扩增条带
模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。
对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
3、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

4、出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
5、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
参考资料来源：百度百科-PCR扩增

4. 为什么 pcr后有两条带？？？拜托了各位 谢谢

能否详细描述一下两条带的位置，另外你以什么作为template？cDNA？  因为一般情况下引物二聚体的条带都是或多或少的存在的。  如果是目的条带有两条，那么可能是引物出现了错配，也有可能是本身就有两种可能。回收测序即可。   追问：  两条带距离很近，一条很亮一条很暗，用的DNA基因组   回答：   基因组DNA的话有杂带几乎不可避免，因为错配可能很大，挺正常的。  如果两条带距离很近、又基本符合你目的片段的大小的话，可以继续跑胶让它们分开一些，然后切胶回收，连接T载体，转化涂板，挑菌测序。挑对的就行了。

希望采纳

5. PQE30酶切后几条带？

这个这样看你用几个酶切了，PQE30是环状的，单酶切就应该是变成直链的就是一条带，双酶切质粒就应该跑出两条带。 
前提是酶切的彻底，如果不彻底，还有杂带。

6. 基因组PCR扩增条带很宽可能的是什么原因？有哪些可以解决的方案？（连续几次实验做出来的条带都比较宽）

很宽极有可能是扩增出两个或多个大小相近的片段，这种片段测序结果往往都是乱封，是多个序列测序结果叠加在一起的。解决办法，更换特异引物，或者胶浓度加大，比如2%的。电泳时间久一些，比如40分钟，就有可能将其分开，然后再切胶回收。

7. WB杂出来的actin为什么两条带

出现两条带是非常正常的现象.
抗体的原因：不同厂家的抗体特异性会出现不同的差异,大部分都能检测到目的条带,但是有时能检测到非特异性的条带；
蛋白亚型表达的原因：我做了大概两年半的WB,经常会发现,一种蛋白有时检测压型很明显,有时不是很明显.参考了很多文献的结果,均有此种情况出现,即使是大家都觉得很确定的蛋白很多时候也会出现不同的亚型.毕竟对很多蛋白我们的认识有限.这种情况不要怕的,尽管按照真实结果去处理,千万不要为了让结果好看或者符合大家的意思而去做修改.
3.实验技术的原因：曝光的时候会有底片轻微移动的现象,出现很接近的两条.
4.目的蛋白部分降解,也可能会出现相近的两条带.如何去掉杂带?我觉得你先找找你的目的蛋白的分子量,这样就能分辨出那个条带是你像要的.尽量减少蛋白的降解在样品的处理过程中.
杂带：若是多克隆抗体或是抗体浓度过高就可能有杂带.但是目的条带也会在其中,除非你的样品中靶蛋白表达过低才会出现没有目的条带的情况,封闭时间不够也可能出现杂带
总之,只要目的条带有出现,或者在附近都是没有问题的.此外,还可以再做mRNA进一步验证.祝您实验顺利.