PCR技术只是对已有基因进行扩增，又怎么算是获取目的基因的方法？

1. PCR技术只是对已有基因进行扩增，又怎么算是获取目的基因的方法？

PCR技术是DNA扩增技术，它能在比较短的时间内产生大量的DNA。在获取目的基因后才使用PCR技术。
获得目的基因的方法：
一、构建基因文库
提取总DNA。
用限制性内切酶将总DNA切成小片段，连到质粒或噬菌体载体上，把这些质粒转化到细菌，随着细菌繁殖而复制，这个过程又称为基因克隆（gene
clone）
将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库（gene
library）。
二、反转录人工合成互补DNA
细胞核中转录的mRNA，已经加工去除内含子，只有外显子（编码蛋白质的序列），比构建基因文库优越，因此，先从细胞中提取所需的mRNA。
以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补的DNA片段(complementary
DNA,
cDNA)，在逆转录完成时，
mRNA被降解。在大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下，再以第一条DNA为模板，合成另一条互补DNA链。
优点
在细胞分化各阶段细胞往往转录出特异的编码特殊蛋白质的mRNA。因此，用cDNA方法获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因。

2. 什么是PCR扩增目的基因？

PCR扩增：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法

3. 请简述PCR技术扩增目的基因的基本过程？？

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
  2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
  3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。
  每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

4. 请简述PCR技术扩增目的基因的基本过程?

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
    2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链.
    3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延伸,合成与模板互补的DNA链.
    每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍.

5. PCR扩增技术获取目的基因的原理是?？

PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍,1,①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DN...,2,不太懂,1,这个！！！！！,1,

6. 基因扩增的基因扩增-PCR技术

 多聚酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。1．变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2．退火：使溶液温度降至50－60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。 1.PCR热循环仪 2.移液器（0.1-2.5μL）3.PCR板实验试剂1．10×缓冲液：500mmol/LKCI、100mmol/LTriS·HCI(pH8.3，室温）、15mmol/LMgCl22.dNTPMix：2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP3.Tag酶5U/μL：4.DNA模板1ng/μL：5.引物16.引物27.引物溶液浓度2uM 1．在200ulEppendorf管内配制20ul反应体系2．按下述程序进行扩增94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min30s30cycle；72℃延伸4min；4℃pause 1．引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；2．PCR反应的各种成份不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；3．根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；4．注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。

7. PCR基因扩增,等长的目的基因是怎么得到的?以图示方式表达

PCR技术是DNA扩增技术，它能在比较短的时间内产生大量的DNA。在获取目的基因后才使用PCR技术。
获得目的基因的方法：
一、构建基因文库
提取总DNA。
用限制性内切酶将总DNA切成小片段，连到质粒或噬菌体载体上，把这些质粒转化到细菌，随着细菌繁殖而复制，这个过程又称为基因克隆（gene clone）
将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库（gene library）。
二、反转录人工合成互补DNA
细胞核中转录的mRNA，已经加工去除内含子，只有外显子（编码蛋白质的序列），比构建基因文库优越，因此，先从细胞中提取所需的mRNA。
以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补的DNA片段(complementary DNA, cDNA)，在逆转录完成时， mRNA被降解。在大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下，再以第一条DNA为模板，合成另一条互补DNA链。
优点  在细胞分化各阶段细胞往往转录出特异的编码特殊蛋白质的mRNA。因此，用cDNA方法获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因。

8. PCR基因扩增原理？

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。
　　PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。
　　为了使PCR技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。
　　一、PCR的基本原理和基本程序
　　PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
　　PCR的扩增倍数Y=（1+E）n,这里Y是扩增量，n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次，靶DNA将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若E=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dNTp 浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。
　　二、PCR的特点
　　（一）特异性高：首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显著地提高PCR产物的特异性，序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。
　　（二）高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。
　　（三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。
　　（四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相应酶切位点的载体中。
　　（五）可扩增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将得到的单链cDNA进行PCR扩增，即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的DNA中，难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板，则可将外显子集中，用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。